是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。
制备方法 固定化技术是通过化学或物理等手段将酶分子束缚起来供重复使用的技术。大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。
载体结合法 将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。
① 共价结合法 是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子(聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固定化酶,酶和载体的连接键结合牢固,使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。
② 离子结合法 通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法。能引起离子结合的载体,除具有离子交换基团的多糖类外,象离子交换树脂（见离子交换剂）那样的合成高分子衍生物也可用作载体。离子结合法与共价结合法比较,操作简便,处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶。但载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响。
③ 物理吸附法 将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。常使用的载体有活性炭、氧化铝、高岭土、硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等。物理吸附法操作简便、费用较省,可供选择的载体类型多,有的可以再生。但酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶容易从载体上脱落，酶的非专一性吸附会引起酶的部分或全部失去。
交联法 利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的 α- 氨基、赖氨酸的 ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。
包埋法 将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
应用 酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH值的变化，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产（或在反应器中进行批式搅拌反应），也可以制成酶膜、酶管等多种形式的酶反应器。随着固定化酶技术的发展，许多工业生物反应过程已相继问世。固定化酶作为现代生物技术的一个新的领域，发展很快。目前在工业上应用的数量并不多，这是因为在多数情况下酶的价格昂贵，一般酶活力的回收率不高，辅酶的再生较困难。所以，固定化酶作为生物催化剂主要用于生产精细的特殊化学品、药品，在食品工业中由于生物催化剂较化学催化剂安全，也将得到广泛使用。同时，固定化酶用于各种疾病的诊断、治疗及人工脏器；用作化学分析的酶电极；固定化酶用作燃料电池；固定化酶用作亲和层析手段，分离和提纯酶的底物、辅酶、抑制剂及抗体等，显示出广阔的前景。
此外，固定化细胞是在固定化酶基础上发展起来的，它不但省去了酶的提取工艺，而且使许多生化物质的生产，特别是需要多酶的发酵法生产改变成菌体中复合酶系的连续化反应。如果被固定的微生物细胞是仍处于生存状态的活细胞，则供给一定营养后，细胞将继续生长繁殖。这种固定化微生物活细胞技术的发展，是工业发酵的新方向。